呋喃妥因代謝物ELISA試劑盒

使用說(shuō)明書(shū)

【產(chǎn)品簡(jiǎn)介】

硝基呋喃類(lèi)藥物因有非常好的抗菌作用和藥動(dòng)力學(xué)的特性，曾經(jīng)被廣泛應(yīng)用，作為禽類(lèi)、水產(chǎn)和豬促生長(zhǎng)的添加劑。呋喃妥因在1995年被禁用。由于硝基呋喃類(lèi)藥物在體內(nèi)很快就能被代謝，而在組織中結(jié)合的代謝產(chǎn)物則能存留較長(zhǎng)的一段時(shí)間，所以管理部門(mén)就以檢測(cè)代謝產(chǎn)物為手段達(dá)到檢測(cè)硝基呋喃類(lèi)殘留的目的。

呋喃妥因代謝物快速檢測(cè)試劑盒具有方便、快速、靈敏等特點(diǎn)，適用于動(dòng)物組織（水產(chǎn)、雞、豬、牛）、牛奶等大批量樣品中的呋喃妥因代謝物快速檢測(cè)。

【測(cè)定原理】

本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)水產(chǎn)和雞肉等組織樣本中的AHD，在微孔條上預(yù)包被上偶聯(lián)抗原，利用抗原與抗體的特異性免疫化學(xué)反應(yīng)的原理來(lái)進(jìn)行的，樣本中的AHD和微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗呋喃妥因代謝物的衍生物抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣品中的AHD含量與樣品的吸光度值呈反比，與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較即可得出呋喃妥因代謝物含量。

【試劑盒技術(shù)指標(biāo)】   

規(guī)       格：96孔/盒

靈 敏 度： 0.05ppb

檢測(cè)時(shí)間： 45min

樣本檢測(cè)下限：

水產(chǎn)品、動(dòng)物組織……………………… 0.3ppb

蜂蜜……………………………………… 0.3ppb

參考標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21311-2007 檢測(cè)下限為0.5ppb

交叉反應(yīng)率：

呋喃妥因代謝物……………………………… 100%

呋喃西林代謝物………………………………﹤0.1%

呋喃它酮代謝物………………………………﹤0.1%

呋喃唑酮代謝物………………………………﹤0.1%

回收率：

組織、肝臟………………………………90%±15%

蜂蜜、牛奶、腸衣………………………80%±15%

【試劑盒組成】   

1、 微量測(cè)試孔：1×96孔板（12條×8孔）

2、 標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb

3、 高濃度標(biāo)準(zhǔn)品×1瓶：（1ml/瓶）100ppb

4、 酶標(biāo)記物      7ml………………… 紅色帽

5、 抗體工作液  7ml………………… 藍(lán)色帽

6、 底物A液     7 ml………………… 棕色帽

7、 底物B液     7 ml ………………… 黑色帽

8、 終止液     　7 ml ………………… 黃色帽

9、 20×濃縮洗滌液40 ml…………… 白色帽

10、 2×濃縮復(fù)溶液 50 ml …………… 藍(lán)色帽

11、 衍生化試劑　 10ml ………………黑色帽

【所用儀器、試劑】   

具備的儀器：微孔酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）

微量移液器：?jiǎn)蔚?/span>20µl-200µl，100µl-1000µl、 多道250µl

試          劑：*、乙酸乙酯、正己烷、磷酸氫二鉀、濃HCl

【實(shí)驗(yàn)前溶液配制】

配液1、將2×濃縮復(fù)溶液用去離子水按照1：1稀釋?zhuān)?/span>1 份濃縮復(fù)溶液+1份去離子水）用于樣本的復(fù)溶。

配液2、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照 1：19稀釋?zhuān)?/span>1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

配液3、 0.1MK₂HPO₄  稱(chēng)11.4g K₂HPO₄·3H₂O

加去離子水溶解定容至500ml。

配液4、1M HCl溶液

取8.6ml濃HCl加去離子水定溶至100ml。

配液5、1M NaOH溶液

               取4g NaOH加去離子水定容至100ml。

【樣本前處理方法】   

樣本處理前須知

處理任何樣本時(shí)，都必須注意：

（1）本試劑盒所檢測(cè)的組織樣本包括：動(dòng)物組織、禽類(lèi)和水產(chǎn)組織。eg:雞、鴨、豬、牛、羊、兔、魚(yú)、蝦等。

（2）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。

（3）實(shí)驗(yàn)前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必要時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

樣本前處理步驟：

該方法為氯霉素和硝基呋喃類(lèi)四項(xiàng)同時(shí)檢測(cè)的五合一前處理方法；用本方法制備出的樣品提取溶液可以直接同時(shí)應(yīng)用于本公司研發(fā)的氯霉素和呋喃唑酮代謝物、呋喃妥因代謝物、呋喃妥因代謝物、呋喃西林代謝物檢測(cè)試劑盒。(備注：使用該五合一前處理方法檢測(cè)氯霉素時(shí)，因存在一定的干擾；樣本檢測(cè)下限為0.3ppb）

(a) 水產(chǎn)、組織、蜂蜜

1、 取2±0.05g均質(zhì)樣本樣本，加入 4ml的去離子水，0.5ml1M HCl和100µl衍生化試劑，充分振蕩。

2、 置于37℃恒溫箱孵育過(guò)夜（大約16h）或90℃水浴中孵育20min；

3、 分別加入5ml 0.1M K₂HPO_4， 0.4 ml 1M NaOH和5ml乙酸乙酯，充

          分振蕩2min；

4、 在室溫下（20-25℃）4000r/min以上離心5min。

5、 取出2.5ml上層清亮液體到另一潔凈離心管中，于65℃氮?dú)?/span>/空

氣吹干。

6、 用1ml正己烷溶解干燥物，加入1ml已稀釋好的復(fù)溶液充分混合

30s；在室溫下（20-25℃）4000r/min以上離心5min。

7、 取50µl下層用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：1

(b) 特殊樣本(畜禽產(chǎn)品組織、肝臟、腸衣、油炸食品、混合肉餡、熟食等)的處理方法

1、 取2±0.05g的均質(zhì)樣本于50ml離心管中，6ml的去離子水，充分振蕩2min，加入5ml正己烷，充分混合震蕩3min,4000r/min離心10min。

2、 棄除上層有機(jī)相液體，吸取4ml下層清澈液體于另一個(gè)50ml離心管中，加0.5ml1M HCl和100µl衍生化試劑，充分振蕩。

3、 置于37℃過(guò)夜孵育（大約16h）或90℃水浴中孵育20min；

4、 分別加入5ml 0.1M K₂HPO_4， 0.4 ml 1M NaOH和5ml乙酸乙酯，充分振蕩2min；在室溫下（20-25℃）4000r/min以上離心5min。

5、 取出2.5ml上層清亮液體到另一潔凈離心管中，于65℃氮?dú)?/span>  /空氣吹干。

6、 用1ml正己烷溶解干燥物，加入1ml已稀釋好的復(fù)溶液充分混合30s，在室溫下（20-25℃）4000r/min以上離心5min。

7、 取出50µl下層用于分析。

        樣本稀釋倍數(shù)：2

【酶標(biāo)免疫分析程序】

操作步驟：

1、 從4℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 取出需要數(shù)量的微孔及框架，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

4、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本 50µl/孔到各自的微孔中，加入酶標(biāo)記物50µl/孔,然后加入抗體50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕震蕩混勻。25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。

5、 取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250µl/孔洗板4-5次，每次間隔15-30秒，用吸水紙墊好后拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6、 顯色：每孔加入底物A液50µl，再加底物B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。

7、 測(cè)定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測(cè)定每孔OD值。

【結(jié)果判定】

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與AHD的含量成負(fù)相關(guān)。

1、粗略判定：

用樣品的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出樣本所含AHD濃度范圍（ng/ml）。假設(shè)樣品1的吸光度值為0.239，樣品2的吸光度值為1.1270，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為1.821；0.05ppb為1.464；0.15ppb為1.163； 0.45ppb為0.677； 1.35ppb為0.297； 4.05ppb為0.104。則樣品1的濃度范圍1.35ppb-4.05ppb；樣品2的濃度范圍0.15ppb-0.45ppb。乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中AHD實(shí)際濃度。

2、定量判定：

所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以AHD標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中AHD實(shí)際濃度。

若利用試劑盒專(zhuān)業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣品的準(zhǔn)確、快速分析。

3、標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線(xiàn)：

B/B0 (%)

         0.05      0.15      0.45       1.35       4.05

AHD(ppb) [µg/kg]

圖1： 呋喃妥因代謝物檢測(cè)試劑盒的回歸曲線(xiàn)

4、再現(xiàn)性：

%CV

          0      0.05    0.15    0.45    1.35     4.05

                                         AHD(ppb) [µg/kg]

        圖2：呋喃妥因代謝物檢測(cè)試劑盒的精密度

由多個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出呋喃妥因代謝物檢測(cè)試劑盒的精密度情況，獲得的標(biāo)準(zhǔn)吸收值的變異系數(shù)（%CV）對(duì)相應(yīng)呋喃妥因濃度作曲線(xiàn)，可以看到在全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。

【注意事項(xiàng)】  

1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標(biāo)本沒(méi)有回到室溫（20-25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)不成線(xiàn)性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過(guò)了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號(hào)的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進(jìn)自封袋密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無(wú)色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線(xiàn)下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A_450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過(guò)高或過(guò)低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【儲(chǔ)存】

原包裝應(yīng)儲(chǔ)存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

有效期12個(gè)月;生產(chǎn)日期、有效期、生產(chǎn)批號(hào)見(jiàn)外包裝。